零基础也能读懂的luciferase经验贴

发布时间：2021-11-14

一、荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(Luciferin)或脂肪醛(Firefly Aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

目前应用最为广泛的是北美萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶。萤火虫荧光素酶基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，海洋腔肠荧光素酶是一个 36 kDa单亚基蛋白质，纯化自天然来源的Renillareniformis。两者无需表达后修饰，直接具有完全酶活性。

Promega公司的Dual-Luciferase试剂盒是目前最常用的双荧光素酶报告基因检测试剂盒。多用于检测细胞内蛋白-核酸互作。NEB公司开发的专用于细胞外分泌的荧光素酶检测系统Gluc和Cluc。

二、发光机制

萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光。

三、应用范围

双荧光素酶报告基因检测系统主要用于表观遗传以及转录组学中核酸-核酸、核酸-蛋白之间相互作用的验证。

核酸-核酸：miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA相互作用等。

核酸-蛋白：转录因子-启动子相互作用等。

四、实验原理

在荧光素酶报告基因载体的荧光素酶编码区的3’UTR插入miRNA靶基因的结合序列（3’UTR片段），然后将构建好的载体转染细胞并调控细胞中相应miRNA的表达水平，通过检测荧光素酶的表达情况以分析靶基因是否和miRNA有互作关系。

若验证转录因子调控下游靶基因作用，需将预测的靶基因启动子替换荧光素酶编码区的启动子，同时转染该转录因子ORF序列的表达质粒，检测荧光强度，分析转录因子对对靶基因调控机制。

五、质粒选择

五、优点

1.灵敏度比WB高1000倍以上；

2.内源性低，哺乳动物无内源性表达；

3.荧光信号稳定；

4.检测手段便捷；

5.检测范围广，大于7个数量级；

六、注意事项

1.根据研究内容的不同来选择插入位点。转录因子-启动子研究时，插入位点应选择Luc片段之前。miRNA-mRNA研究时，插入位点应选择在Luc片段之后。

2.由于酶的反应受温度影响较大，试剂和样品都应达到室温在进行检测。

3.萤火虫荧光素酶，统一配制，分装保存于-70℃，不能反复冻融。

4.海肾荧光素酶现配现用，不能长期保存。

5.单管测量时每次应保持样品和试剂混匀后1-2s内进行测量。

6.吹打混匀过程中尽量不要出现气泡，影响测量的准确性。

7.萤火虫荧光数值应控制在107数量级，海肾荧光数值应控制在不超过108数量级。如果测量值不符合要求，可以对转染或检测体系进行调整。

赫贝经验

1.为了保证数据准确性，实验一般需要做3个或3个以上复孔。

2.细胞培养时间不宜过长，最好控制在12-36h。

3.海肾萤光素酶最好选用pRL-TK等携带中等强度启动子载体，尽量不使用SV40、CMV等强启动子载体。

4.正式测量前可以先进行一次空测（只测底物，不加样），作为仪器的背景值，一般背景值应小于100。

5.测量体系一般选择20μl细胞裂解产物，100μl萤火虫荧光素酶底物，100μl海肾荧光素酶底物（或10，50，50）。测量体系也可据实调整，但一定要保证底物足量。